34.5.4.4 Kandidaten für molekulare Schrittmacher in Drosophila: period und timeless

Die molekulare Analyse von period machte auch klar, daß period-mRNA circadianen Fluktuationen unterliegt, die sich in den erwähnten Mutanten jeweils verlängern oder verkürzen. Das Period-Protein läßt sich sowohl im Cytoplasma zahlreicher Zellen nachweisen, als auch mit einer charakteristischen Verzögerung im Zellkern, wobei eine Verzögerung von mehreren Stunden zwischen den Peaks der mRNA- und der Proteinkonzentration zu beobachten ist (Abb. 34-68). Damit erfüllt period eine der Anforderungen, die an einen autoregulatorischen Feedback-Loop gestellt werden. Ferner läßt sich die Phase des Eintritts von Period in den Nucleus klar von der cytoplasmatischen Phase unterscheiden. In Mutanten mit verlängerter Periodizität ist auch eine Verzögerung des Kern-Importes festzustellen. Während der cytoplasmatischen Phase wird Period zunehmend phosphoryliert. Sollte die Phosphorylierung einen reaktionsratenlimitierenden Schritt für den Kernimport darstellen, erfüllt diese Reaktion gleich einem molekularen Uhrenpendel die Bedingung der Phasenverzögerung.

Gegen Ende des circadianen Zyklus läßt sich ein erhöhter proteolytischer Abbau von Period feststellen, womit die Phase der Transkriptionsaktivierung eingeleitet wird. Das Period-Protein hat Ähnlichkeit mit den Transkriptionsfaktoren der Helix-Loop-Helix-Klasse, allerdings ohne DNA-bindende Eigenschaften. Period und eine kleine Anzahl verwandter Proteine besitzen außerdem eine gemeinsame Protein-Protein-Interaktionsdomäne, die sogenannte PAS-Region, mit der sie entweder Homo- oder Heterodimere bilden können. Bei der Besprechung der Gene des Enhancer-of-Split-Komplexes und der Produkte der Proneuralgene wurde bereits auf die Bedeutung von homotypischen und heterotypischen Komplexen für die Regulation ihrer Aktivität eingegangen. In Analogie zu diesem Prinzip bieten sich hypothetische Bindungspartner von Period als Modifikatoren des Regelkreises an, welche entweder die Translokation von Period in den Nucleus steuern, oder die Interaktion mit alternativen Partnern inhibieren.

Bei der molekularen Analyse zahlreicher Period-Homologe erwies es sich, daß das Gen große Regionen hochgradig polymorpher Sequenzen aufweist, insbesondere eine Region von Ser-Thr-Wiederholungssequenzen, deren Länge sich selbst zwischen nahe verwandten Spezies deutlich unterscheidet. Diese Längenpolymorphphismen wurden zunächst für phänotypische Frequenzvariationen des period-Regelkreises verantwortlich gemacht.

Um diese Bedeutung zu untermauern, transferierten Hall und Mitarbeiter das period-Gen der Spezies Drosophila simulans durch Keimbahntransformation in eine Null-Mutante von D. melanogaster. Das verblüffende Ergebnis war, daß sich die Rhythmizität der fremden Spezies mit dem Gen tatsächlich auf D. melanogaster übertragen ließ. Damit dürfte period ein sehr geeignetes Studienobjekt für Untersuchungen der sexuellen Selektion sein. Die funktionelle Signifikanz der Polymorphismen ist allerdings bis heute nicht geklärt. period-Homologe wurden inzwischen auch aus anderen Insekten isoliert, und im Falle des Seidenspinners ließ sich die funktionelle Identität auch durch Keimbahntransformation in Drosophila zeigen.

Die Funktion von period ist zellautonom

Um die Frage zu beantworten, ob die Oszillationen des period-Gens im Gehirn der Fliege zellautonome Effekte haben, produzierten die Arbeitsgruppen von Michael Rosbash und Jeff Hall Gewebemosaike, bei denen Teile des Fliegenhirns das wildtypische Genprodukt enthielten, neben Klonen von Zellen, die kein period-Produkt produzierten. Diese Experimente wurden später ergänzt durch ektopische Expression von period unter der Kontrolle des Opsin-Promotors. Dieser konstitutive Promotor produziert period-mRNA in großen Mengen, aber lediglich in den Rezeptoren der Retina. Die hohe und nicht fluktuierende Expression des period-Gens führte hier zum gewebsspezifischen Anhalten eines putativen Schrittmachers, ohne jedoch die Aktivitätsrhythmik der Versuchstiere zu beeinflussen. Das bedeutet, daß sich ein Feedback-Mechanismus innerhalb einer Zelle abspielen muß. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, daß endogenes period-Gen in der Retina nur auf unterstem Niveau transkribiert wurde, was die Hypothese erhärtet, daß das period-Genprodukt seine eigene Transkription inhibiert und ein Teil des negativen Feedback-Loops ist. Praktisch als komplementäres Experiment dazu wurde period außerdem unter der Kontrolle eines Hitzeschock-Promotors ubiquitär exprimiert. Durch kurze Hitzepulse konnte period willkürlich in allen Zellen hochreguliert werden. In Übereinstimmung mit der Theorie, daß period ein intergraler Bestandteil des Oszillators ist, konnte die innere Uhr der Fliege durch entsprechend angelegte Hitzeshockpulse willkürlich verstellt werden (Abb. 34-69).

timeless kontrolliert period-Expression

Bei der Suche nach interagierenden Genen und Modifikatoren der "inneren Uhr" von Drosophila wurde ein weiterer Locus identifiziert, dessen Mutation zum Verlust von lokomotorischen Aktivitätsrhythmen und Schlüpfverhalten führt und daher timeless (tim) genannt wurde. Bei Ausfallmutationen von timeless ist die typische circadiane Fluktuation der period-mRNA nicht vorhanden, was auf eine Interaktion der beiden Loci hinweist. Zusätzlich findet sich in solchen tim--Fliegen das Period-Protein nur noch im Cytoplasma, was eine Rolle von Timeless für die subzelluläre Lokalisation oder den Transport von Period in den Nucleus impliziert.

timeless codiert für ein Protein ohne offensichtliche Homologien zu bereits bekannten Proteinfamilien oder zu Period. Es wurden jedoch sowohl genetische wie direkte Hinweise auf die physikalische Interaktion von Timeless mit Period gefunden. Darüber hinaus stellte es sich heraus, daß eine period-Mutation mit verlängerter Phase (perL) die Fähigkeit zur Interaktion mit dem Timeless-Protein verloren hatte (s. Abb. 34-68).

Interessanterweise ist die Interaktion zwischen Period und Timeless in verschiedenen In-vitro-Tests temperaturunabhängig, während die Interaktion zwischen Timeless und dem Produkt des perL-Allels eine klare Temperaturabhängigkeit mit einer zunehmenden Verlängerung der Periodizität zeigt. Daraus ist zu schließen, daß die Interaktion zwischen den beiden Proteinen Teil des Kompensationsmechanismus ist.

Doppelmutationen in timeless und period führen zum Totalverlust circadianer Oszillationen. Darüber hinaus verliert das period-Transkript und sein Proteinprodukt jede Periodizität; auch die charakteristische Translokation von Period in den Nucleus unterbleibt. timeless ist also epistatisch zu period. Die Befunde bestätigen ein Rolle von Timeless für den Eintritt von Period in den Nucleus. Es steht offen, ob es sich dabei um ein Transportphänomen oder um eine Stabilisierung des Period-Proteins handelt. Timeless besitzt ebenso wie Period keine DNA-bindenden Eigenschaften, also wird eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Kontrolle des Feedback-Loops ausgeschlossen. Timeless spricht sehr schnell auf äußere Lichtreize an, also auf den Zeitgeber der inneren Uhr. Seine Beteiligung an der Synchronisation des Oszillators mit Umweltreizen wird diskutiert (s.u.).